中国生物工程学会会刊     创刊于2005年

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纳米孔测序技术发展态势分析

时间:2018-05-17来源:未知 作者:丁陈君 陈方 陈云伟 郑颖 邓勇 点击:

自2003年“ 人类基因组计 划”完成之后,测序技术发展迅 猛,测序读长不断加长、通量不 断提升、时间不断缩短,基因组 测序技术成本大大降低,逐渐成 为一项常规技术,测序物种数量 和物种多样性与日俱增。2005 年,第二代测序技术即高通量 测序技术应运而生,并得到广泛 应用[1]。

纳米孔测序技术是近年来 在基因测序领域兴起的一项新 技术,起源于1996年哈佛大学的 Daniel Branton、加州大学的David Deamer等用膜通道检测多核苷酸 序列的实验结果[2]。其主要原理 是让单链DNA的碱基逐个穿过 1nm的小孔,检测不同碱基组合 的特有结构在穿过时产生的电流 变化来进行测序。该测序技术无 需预先扩增或标记DNA,可以 降低测序成本,且可以连续读取 长片段的DNA序列,分析速度 也大大提高,基于这些优势该技 术已受到广泛关注,被认为是最 有可能成为下一代基因测序的技 术之一。2016 年,《科学》杂志 已将基于纳米孔的便携式检测技 术评为十大科技突破之一。2014 年6月,瑞士罗氏集团收购纳米 孔测序公司Genia Technologies。 该次收购将加强罗氏新一代测序 平台。几乎同期, 罗氏还收购 了另一家纳米孔测序公司Stratos Genomics。此外, 作为牛津纳 米孔技术公司早期的主要股东之 一的Illumina公司迫于竞争压力 不得不与牛津纳米孔技术公司对 簿公堂,以抢占该领域的核心专 利。Illumina和罗氏公司加紧在纳 米孔测序技术领域的布局凸显了 该技术广阔的发展前景。

纳米孔测序技术自其理论诞 生以来已发展了20年,最初的理 念非常直观,但实施过程中遇到 很多问题。在美国国立卫生研究 院“1000美元基因组计划”的激 励下,越来越多的研究人员加入 到解决碱基穿过纳米孔时的检测 手段、穿过速度以及纳米孔本身 的改良等技术难题的行列。

2005年,由于IP集团种子基 金的资助,英国牛津纳米孔技术公 司(Oxford Nanopore Technologies) 成立,并于2012年发布其纳米孔 测序平台——MinION。该平台只 有U盘大小,价格仅1000美元左 右,能对很长的DNA进行测序, 由此开启了纳米孔测序技术的商 业化新篇章。2013 年11月,该公 司启动MinION测序仪的早期试 用计划。2014年的基因组生物技 术进展大会上,首批试用数据公 布于众。随后其他各试验项目的 数据陆续发布。英国埃克塞特大 学研究小组对MinION 的性能进 行了评估,他们认为作为首个基 于纳米孔的单分子测序仪,MinION 前景值得期待,但目前约38%的错 误率则限制了其竞争力[3]。瑞典于 默奥大学研究小组利用MinION 构建细菌基因组骨架,序列读取 还有待改进,但未来在组装基因 组、现场快速检测生物体方面的 应用令人期待[4]。

2009年3月,美国纳米孔测序 公司Genia Technologies 成立,其 传感器技术及其专有的NanoTag 化学技术可以实现准确读取,克 服了早期纳米孔测序工作面临的 诸多限制。

2015年,牛津纳米孔技术公 司创始人Hagan Bayley和牛津大学 等研究人员在高通量检测纳米孔离 子流变化情况方面取得突破性进 展。他们开发了光传感纳米孔芯 片,将纳米孔离子流变化转化为荧 光变化,从而进行高通量检测[5]。 2016 年3月,美国哈佛大学和哥 伦比亚大学团队开发了基于纳米 孔的单分子边合成边测序(SBS) 系统,可以在单分子水平上对多个 DNA模板进行平行测序,分辨率达 到了单碱基水平[6]。

1 研发现状分析

1.1 文献计量

以科学引文索引扩展版(science citation index expanded,SCI-E)作 为数据源对纳米孔测序技术进行 文献检索,文献类型不限,相关 论文共1091 篇(检索时间2017 年 4 月5 日)。

通过对纳米孔测序技术的论文 进行统计后发现,该技术论文数量 增长较为缓慢,说明其技术发展较 为慢热(图1)。随着技术的不断 发展,商业化进程的推进,纳米孔 测序技术也将日益受到关注。

1.1.1 国家分布

从发文量TOP10国家来看, 美国具有绝对的优势,共发表纳 米孔测序技术领域的论文548 篇, 是排名第二的中国的近3 倍。英 国排名第三,排名第4 ~ 10的国 家发文量差异不明显(表1)。

从被引情况来看, 发文量 TOP10国家中,篇均被引次数前 三的分别是英国、加拿大和美 国,分别为50.37、48.63 和38.08 次,篇均被引次数最少的是瑞 典, 为11.3 次( 表1)。将被引 次数50 以上的论文作为高被引 论文进行统计发现,美国、英国 和中国的高被引论文发文量居于 前三;加拿大、荷兰和瑞士高被 引论文量占发文总量的比例最 大,其次是美国和英国(表2)。 结合发文量和被引情况可以看 出, 美国、英国和加拿大在纳 米孔测序技术领域相对具有较强 的研发实力。



 

1.1.2 主要研究机构

在开展纳米孔测序技术研究 的机构中,美国加州大学系统发 表相关论文数量最多(78篇),美 国伊利诺伊大学系统和中国科学 院分别发表65篇和46篇,位列第 二和第三(图2)。在发文量前十 位研究机构中,有7家美国机构, 2家中国机构和1家英国机构。

1.1.3 国际合作

从开展纳米孔测序技术研究 的机构合作情况来看,位于前十 的机构除加州大学圣克鲁兹分校 与华盛顿大学和加州大学圣克鲁 兹分校与哈佛大学之间的合作较 频繁之外,其余几所机构之间的 合作并不紧密。美国犹他大学几乎独立开展研究(图3)。包括 中国科学院在内的这些机构都 位于小的合作网络中心,说明 这些机构都具有较强的研发水 平,开展以各自为主导的国际 合作研究。

1.2 专利分析

以汤森路透Web of Science平 台中Derwent Innovations IndexSM 数据库(DII数据库)作为数据 源,分析纳米孔测序技术专利的 发展情况(数据下载日期为2017 年5 月31 日)。

1.2.1 时间趋势

从图4 可以看出纳米孔测序 技术相关专利保护情况的年度发 展趋势,1999 ~ 2016 年该技术 发明专利数量总体呈缓慢增长趋 势,1999 ~ 2004 年主要处于技 术引入期,2005 ~ 2009 年专利 公开数量没有大的突破,处于技 术瓶颈期,许多技术仍处于研发 阶段,2010 年以后纳米孔测序 技术进入快速发展阶段,尤其是 2012 年首台测序仪问世标志着 技术真正实现商业化,专利公 开数量激增,至2016 年已达到 101 件( 图4)。这一趋势说明 纳米孔测序技术已逐渐受到各 界重视。

1.2.2  专利受理国家/地区分布

由相关专利受理国家/ 地区 分布情况可以看出,美国、欧 洲、中国是纳米孔测序技术专 利申请人最重视的市场保护地, 其次是日本、加拿大、澳大利亚(图5)。

1.2.3 主要申请机构

由纳米孔测序技术的主要申 请机构可以看出,英国牛津纳米孔 技术公司、美国Genia Technologies 公司和美国Pacifi c Biosciences公司 的专利申请数量居全球前三。专利 申请数量TOP10机构中,除英国 牛津纳米孔技术公司和瑞士罗氏公 司以外,其余8家机构均为美国机 构,其中6 家为美国公司,还有 2 家为加州大学和哈佛大学,可 见美国在该领域具有垄断优势 (图6)。

1.2.4 相关专利的研发重点 将纳米孔测序技术专利根据 国际专利分类号进行分类,专利 申请数量最多的10个分类号如 表3所示。根据分类号对应的注 释可知,目前纳米孔测序技术相关专利主要集中在包含酶或微生 物的测定或检验方法;其所用的 组合物或试纸;组合物的制备方 法;在微生物学方法或酶学方法 中的条件反应控制(C12Q) 领 域,其次是借助于测定材料的化 学或物理性质来测试或分析材料 (G01N)领域等。

 

2 应用前景 2.1 即时检测传染源 第二代测序平台的广泛使 用,填补了之前在传染病爆发时 诊断检测方面的缺口,但与PCR、 ELISA技术一样,存在检测时间 过长的问题,而纳米孔测序技术 能很好地弥补这方面的不足。

 

2015年4月,欧洲移动实验 室项目(EMLP) 成员和美国 NIH的团队利用MinION测序仪 在48h内读取了14名患者的埃博 拉基因组,由此帮助医生诊断患 者病因,并快速绘制系统发育树, 从而确定感染的源头。2016年2 月3 日,Nature首次报道了利用 纳米孔测序技术对埃博拉病毒进 行实时测序的成功例子[7]。

 

2.2 基因组组装 英国埃克塞特大学在评估MinION系统时发现,结合Illumina MiSeq数据,并依靠其长读长的 优势在基因组复杂区域组装方面 具有良好的效果[3]。 2016 年12月初,牛津纳米孔 技术公司主办的行业交流会上宣 布首次使用Oxford Nanopore掌上 测序仪完成了对一个人类标准样 本NA12878的测序和一位牛津生 物医学研究中心的患者的测序, 由此打开了大规模使用纳米孔测 序技术的大门。

 

2.3 基因诊断 哈佛大学研究小组开发了一 种基于纳米孔的电子DNA测序 平台。这个新的测序机器包括7 个蛋白质亚基,共同组成了1 个 复杂的纳米孔,其中只有1 个可 以在正确的孔道开放时间、正确 的位置特异性地与DNA聚合酶 共轭[8]。该成果将生物大分子机 器与合成膜结合在一起,然后 整合到常规电子机器中,创造 了一种全新的低成本基因诊断 技术。

 

2.4 太空应用 2016年7月,一台MinION测 序仪搭乘SpaceX 9号进入国际空 间站,对细菌、病毒和小鼠DNA 进行测序,所得数据发回地球, 在此基础上研究人员对MinION 在不同环境下的工作状态进行评 估,以验证MinION在微重力下的 性能,并为下一步探索做好准备, 为未来更多科学研究提供支持。 此外,小型便携式DNA测序 仪还在科研、药物定制、食品安 全检测、农作物科学研究、环境 监测以及安全防护等许多方面具 有应用潜力,在推进基于基因组 技术的个性化医学方面也将做出 巨大贡献。

 

3 结 论 通过文献计量和专利分析来 看,目前纳米孔测序技术仍处于 发展初期,许多技术还在研发 阶段, 受关注程度不太高。美 国、中国和英国在纳米孔测序技 术领域发文量方面居前三位。美 国和英国在高被引论文发表数量 和发文总量占比方面处于领先地 位。在专利申请方面,产业界的 申请人占多数,美国专利权人在 纳米孔测序技术专利申请方面具 有垄断优势。加州大学和哈佛大 学在论文发表和专利申请方面都 居于世界前列。中国科学院和东 南大学是发表相关论文总数进入 TOP10机构。由发文量、发文质 量和专利申请数量的机构排名可 以看出,美国和欧洲都具有很强 的研发实力,并且这些国家/地 区的市场也十分受重视。

 

目前,纳米孔测序技术正向 着长读长、高通量、低成本和小 型化的方向发展,与其他主流测 序技术相比,在速度和成本方面 已显现一定的优势,并且应用领 域相当广泛。未来,该技术在从 测序原理到制造工艺,尤其是序 列读取错误率和平行测序能力方 面还有很大的改进空间。