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基因组工程在微生物细胞工厂构建中的应用进展

时间:2018-05-29来源:未知 作者:何庆 王茜 朱清华 方宏清 点击:

基因组工程是指为了实现某一目标对复制 系统进行有意的、广泛的遗传修饰。目前,人们 对基因组工程的研究正处于快速上升时期。以微 生物细胞工厂替代传统化工厂,将可再生资源转 化为人类所需的能源、药物、化工原料等,是绿 色发展的重要途径之一。目前,以基因组工程为 基础的微生物细胞工厂的构建主要有两条技术路 线:合成简约化的基因组;剔除赘余基因以获得 简约化的基因组。第一条技术路线是以人们对生 物体系研究所获得的技术与知识为基础,将零部 件一步步组建成生物体,重塑生命是其核心思想。 第二条技术路线为大多数研究人员所采用,它主 要针对遗传背景较为清晰的微生物,通过对其基 因组的结构和序列进行分析,分批次敲除非必需 或赘余的基因序列,或通过添加DNA 序列增加 新的功能,提高细胞对底物和能量的利用率以及 生产性能。

1 基因组改造技术

基因组靶向编辑指在基因组DNA 的预定位点 上,精确地改变DNA 序列,包括插入、缺失和置换 等,进而改变基因的结构或功能。该技术是微生物 细胞工厂构建中最常用的技术。

1.1 λ Red 同源重组和CRISPR 技术

λ Red 同源重组是一项可在染色体水平进行遗 传操作的技术,只需较短的同源序列,不需要特定 的限制性酶切位点,即可在生物体内完成重组过 程。而CRISPR/Cas9(clustered regularly interspersed short palindromic repeats/Cas9)技术是由RNA 指导 Cas9 蛋白对靶基因进行修饰,具有组成简单、价格 低廉、安全性高、切点相对精确、具有可逆性、可 同时对多个基因位点进行编辑的优点,被广泛应用 在不同微生物中(表1)。

目前,人们致力于将λ Red 重组酶与CRISPR/ Cas 技术相结合,结合后的系统不仅能够发挥λ Red 重 组酶高效重组的优点,还利用了CRISPR/Cas 识别特 异性序列并产生双链断裂的特点。如Reisch 等[10]发明的no-SCAR(scarless Cas9 assisted recombineering) 利用λ Red 促进供体DNA 的基因组整合,然后利用 Cas9 切割的双链DNA 来筛选突变株,可实现无痕 基因组编辑。Carlotta 等[11]在MAGE 技术的基础上结 合CRISPR/Cas9 与λ Red 重组,创造出了一种适用于 大肠杆菌的高效快速的基因组工程方法CRMAGE, 该方法对3 个基因组靶标的重组效率高达96.5% ~ 99.7%。

1.2 大片段捕获、合成及组装

DNA 片段的克隆和组装技术是分子生物学的重 要工具。近年来,随着合成生物学的发展,对大片段 的捕获和有效组装显得尤为关键。虽然传统的利用Ⅱ 型限制性内切酶连接克隆的策略仍然在发挥着重要作 用,但由于酶切位点的限制,其在多DNA 片段组装或者 平行无缝克隆方面不足之处也尽显无遗[12]。为此,人们 基于PCR、非典型酶切连接、单链退火拼接、同源重 组等原理,开发出了一系列大片段DNA 克隆与组装 技术,为微生物细胞工厂的构建提供了有效的操作工 具。但这些方法均有其各自的适用范围,还没有一种 方法可以在满足快速平行组装(无痕、无序列依赖性、 可按预设顺序组装)的同时,适用于生物合成途径乃 至基因组的组装。因此,目前最常用的策略是依据目 标DNA 分子尺度、序列的同源性程度和能否容忍疤 痕的存在,将几项最合适的技术联合使用。

一些新方法和新技术的出现,使大片段捕获、 合成及组装操作变得简单。如应用Red 重组直接从 体内克隆染色体上大于10kb 的DNA 序列非常困 难,但朱莹等利用一种抗性拆分- 融合策略成功地 将供体菌基因组上约48kb 的大片段DNA 捕获至质 粒载体上,并将其移植到了受体菌的染色体上,一 次敲除了基因组中4 个非必需区,该方法的发明将 有利于基因组组装和大片段DNA 的功能研究[13]。Red/ET 重组是一种基于体内同源重组的技术,该技 术不受限制位点位置和DNA 片段大小的限制。Bian 等[14]利用RecE/EecT 介导的大肠杆菌线性加线性同 源重组(linear plus linear homologous recombination, LLHR)从丁香假单胞菌的基因组中直接克隆了 syringolin 基因簇,并在大肠杆菌中成功地进行了异 源表达。Huang 等[15]更是将用迭代重组的方法组装得 到的多杀菌素基因簇替换了糖多孢菌体内天然红 霉素聚酮化合物合酶基因,并获得了成功的表达。 此外,还有许多其他的基因组改造方法,如RNA 干扰[16]、PCR 介导染色体分裂技术[17]等。

2 基因组工程在不同微生物细胞工厂中的 应用

2.1 基因组工程在大肠杆菌细胞工厂中的应用

大肠杆菌是使用最广泛的异源表达宿主菌。各 大类天然产物,如非核糖体肽类、聚酮类、苯丙烷 类和萜类化合物,都能在大肠杆菌内异源合成。自 2002 年发表了第一篇大肠杆菌基因组简约化的报道 后,关于大肠杆菌基因组精简的报道如雨后春笋。 Shalini 等[18]构建了一系列可用于单拷贝DNA 序列 整合或者启动子区置换的模板质粒,如pSD1xx 和 pSD2xx,并通过实验证明了其有效性。Wei 等[19] 利 用基因组工程方法构建了大肠杆菌突变株DOPA- 30N,3,4-二羟基苯基-L-丙氨酸(L-DOPA)产量在 5L 发酵罐中60h 能够达到8.67g/L。上述研究成果 表明,基因组的精简往往能够获得意想不到的优良 属性,同时也大大鼓舞了人们构建大肠杆菌细胞工 厂的想法。

将λ Red 重组与CRISPR/Cas9 相结合的策略,不 仅能够解决DNA 大片段或者代谢途径组装过程中面 临的问题,而且已经在很多研究中获得了成功。如Chung 等[1]基于上述策略发明了一种大片段基因精 确整合的方法,能够将7kb 的双链DNA 整合到大肠 杆菌基因组中,且效率超过了60%。Pyne 等[2] 开发 了一种三质粒方法,不仅能够对短单链寡核苷酸进行 高效重组,还能用大片段的PCR 产物替换染色体延 伸片段上的多基因。上述基因组编辑的方法将在大肠 杆菌细胞工厂的构建中发挥越来越重要的作用。

2.2 基因组工程在酿酒酵母细胞工厂中的应用

酿酒酵母是代谢工程中应用最广泛的模式生物 之一,是人们研究细胞周期、蛋白质相互作用的首 选模式生物。酵母细胞工厂对于真菌和植物来源的 次级代谢途径有良好的适应性,然而质粒拷贝数控 制不佳和对持续选择压力的需求限制了其在工业发 酵上的稳定性。因此,更多先进的基因组编辑技术 在酵母中使用并获得了成功。如Murakami 等[17] 通 过分析酿酒酵母染色体基因,利用PCR 介导染色体 分裂技术,获得了缺失531.5kb 的基因组简化菌株, 其乙醇和甘油产量分别是野生株的1.8 倍和2 倍。 目前,人们已经能够利用CRISPR/Cas9 系统 对酵母菌进行基因插入和敲除。Bao 等[3]开发了HICRISPR( homology-integrated CRISPR-Cas) 技术 并首次在酿酒酵母内一步成功敲除了CAN1、LYP1 和ADE2 基因。Shi 等[4] 研制出Di-CRISPR(delta integration CRISPR-Cas)平台,利用该平台可实现 无痕的多基因整合,甚至完整代谢途径的整合将成 为可能。

总之,同源重组技术结合CRISPR/Cas9 技术后, 将成为无痕、一步基因敲除与整合、多基因生物合 成途径组装的强有力的工具。再通过利用灵巧的多 gRNA 克隆表达元件,将来一定能够为人们提供稳 定性更强的工程化的酵母基因组[20]。

2.3 基因组工程在链霉菌细胞工厂中的应用

链霉菌细胞工厂的优点主要体现在3 个方面:

①作为多种次级代谢产物的产生菌,链霉菌体内丰 富的初级代谢途径可以提供充足的前体供应;②链 霉菌具有独特的转录后修饰系统,如磷酸泛酰巯基 乙胺基转移酶催化的反应是Ⅰ型聚酮合酶(polyketide synthase, PKS)及非核糖体肽合成酶(nontibosomal peptide synthetase, NRPS)中关键的蛋白修饰;③如 果在链霉菌自身优良特性的基础上,能够利用基因 组工程开发出培养条件、遗传操作和生长速度接近 大肠杆菌的突变株,将成为合成生物学领域的标志 性成果[21]。因此,全世界的科学家一直对链霉菌基 因组工程的研究情有独钟。

目前,链霉菌细胞工厂的构建主要包括以下几 种策略:基因组的精简和优化、对各类调控子进行 改造和增加前体供应。在此基础上,人们已开发出阿 维链霉菌、天蓝链霉菌、变铅青链霉菌、白色链霉菌 和委内瑞拉链霉菌等链霉菌底盘宿主。Wang 等[22]以 链霉菌FR008 为初始菌株,经过遗传改造后获得了 一系列优势底盘,这些底盘遗传操作非常容易,且 是目前常见链霉菌中生长速度最快的。

CRISPR/Cas9 技术的出现能够解决链霉菌基 因组编辑过程费时费力的难题。人们已经用Ⅱ型 CRISPR/Cas 系统在变铅青链霉菌、白色链霉菌和 产绿色链霉菌中成功地进行了多基因的缺失,编辑效 率大于70%[5]。如Cobb 等[6] 利用含有嵌合gRNA 的 pCRISPomyces-2 系统不仅高效地完成了单基因和双 基因的敲除,还实现了30kb 大基因簇的缺失。Hu 等[23] 将CRISPR/Cas9 和CodA(sm)组合后,发明 了能够快速、高效地编辑链霉菌基因组的CRISPR/ Cas9-CodA(sm)系统。Huang 等[24]构建了一个适合 链霉菌基因操作的高效CRISPR/Cas9 基因组编辑质 粒pKCcas9dO。相信在未来,随着类似于CRISPR/ Cas 的技术在链霉菌中广泛应用,将诞生更多性能优 越的链霉菌宿主,为链霉菌细胞工厂的构建以及新药 的研制提供强有力的支持。

2.4 基因组工程在枯草芽孢杆菌细胞工厂中的应用

枯草芽孢杆菌是工业生产中许多生物制品的宿 主菌。作为一种底盘细胞,人们已经致力于用多种 基因组工程的方法对其基因组进行精简以提高它的 性能和适用性。如Toya 等[25] 构建的纤维素酶产生菌 MGB874 精简了约20.7% 的基因组,在生产碱性纤 维素酶和蛋白酶时表现出了明显的优势。除了能够 生产多种酶类之外,枯草芽孢杆菌还可以用来生产 一些小分子化学物质,如核苷、核黄素、2,3-丁二醇 和乙酰甲基原醇等。Li 等[26]对枯草芽孢杆菌168 的 基因组进行了581.9 ~ 814.4 kb 的精简,构建了多株突变株,发现它们在生长速率、产孢率、转化效 率等方面呈下降趋势。但重新引入外源基因后,鸟 嘌呤和胸腺嘧啶产量分别是野生株的4.4 倍和5.2 倍。

新的基因组编辑技术在枯草芽孢杆菌中的应用 也日益增多。如Josef 等[7]构建了一个可用于枯草芽 孢杆菌基因组编辑的单质粒系统,成功地敲除了枯 草芽孢杆菌染色体上的两个大片段,并对枯草芽孢 杆菌168 中的trpC2 基因突变进行了修复。Westbrook 等[8]建立了一套综合改造枯草芽孢杆菌的CRISPR/Cas9 工具包。因此,我们有理由相信,随着更多先进的基 因编辑技术的应用,将大大推动枯草芽孢杆菌工厂的 构建进程。

2.5 基因组工程在乳酸菌细胞工厂中的应用

乳酸菌具有良好的生物安全性,是公认的安全 级微生物。人们已经完成了多种乳酸菌基因组的测 序,发现同其他微生物一样,其基因组内含有大量 的非必需基因。目前,大部分乳酸菌基因组简化研 究尚不成熟,基因敲除技术还依赖于传统的同源重 组技术,其敲除策略大致可分为3 类:位点特异性 重组、同源单交换基因敲除和线形DNA 重组基因 敲除[27]。

位点特异性重组体系由重组酶和特异性识别位 点组成,该系统具有高度的专一性和保守性。Cre/ loxP 系统和TP901-1/att 系统常用于乳酸菌的位点 特异性重组。如Qiao 等[28] 把质粒pNZ5319 转化入 乳酸乳球菌进行同源重组,随后引入Cre/loxP 系 统消除筛选标记,成功敲除了胸腺嘧啶合成酶基 因thyA。由于乳酸菌含有一层较厚的细胞壁,导致 对其进行遗传操作较困难,重组效率一般较低,但 仍然可以通过优化相关因素(如引入反向筛选标记 和利用温敏复制子)提高敲除效率。Langa 等[29] 利 用敲除载体pORI28(repA-)和温敏质粒pVE6007 (repA+)共同敲除短乳杆菌pdh30 基因,发现该基 因参与3-羟基丙酸的生物合成。

CRISPR/Cas 技术未来极有可能在乳酸菌中得以 广泛应用。van Pijkeren 等[9] 已尝试把CRISPR/Cas 系 统和单链重组系统结合后应用于乳酸菌中。Millen 等[30]从遗传水平对CRISPR/Cas 系统在乳酸菌细胞内 的有效性进行了研究,结果表明CRISPR/Cas 系统 在乳酸菌内部有效且应用前景广阔。此外,ZFNs 和 TALENs 等高效靶向基因修饰技术都有待应用于乳 酸菌中,这将极大地提高基因敲除效率,为乳酸菌 细胞工厂的构建提供强有力的工具。

3 总结与展望

 

利用微生物细胞工厂生产化工和医药产品具 有高效、清洁、附加值高等优点,已成为绿色工业 发展的核心部分。特定环境下,维持细胞正常代谢 所需的最小基因群构成了该细菌的最小基因组。 Masaomi 等[31] 对缺失了不同赘余基因组序列大小的 大肠杆菌突变株的生长情况进行了分析,发现它们 的指数增长率和饱和细胞密度按照与缺失长度成正 比的方式下降,并且该现象与培养基无关。因此, 如何在保证微生物基本正常生长的条件下,利用最 小基因组作为底盘构建相应的微生物细胞工厂,是 需要进一步研究的问题。在对不同微生物基因组的 精简过程中,CRISPR/Cas9 系统因其独特的优势成 为当前的研究热点。

目前,虽然有很多活性化合物及其衍生物在微 生物细胞工厂中成功进行了异源表达,但同时也发现 了一些令人费解的现象[32]。如Smanski 等[33]曾尝试在 S. lividans K4-114、S. coelicolor(CH999、M1146、 M1154)和S. albus J1074 中对平板霉素基因簇进行 异源表达,但只在S. lividans 中获得成功,且是在敲 除了途径特异性调控基因ptnR1 之后,导致这一结果 的原因尚不清楚。因此,一方面需要对合成代谢途径 的调控系统及其底盘适配性的问题进行深入研究,另 一方面,由于任何一种微生物包含的代谢途径不能够 满足所有天然产物异源表达的需求,故开发性能优良 且各具专长的底盘细胞尤为紧迫。

随着基因组工程技术的日新月异,将诞生更多 优良的超级微生物细胞工厂,它们遗传操作快速高 效、本底代谢竞争途径少、培养条件简单、标准化元 件充足、异源化合物提取分离方便、稳定且高产,将 为新药研发和天然化合物产业化提供更强大的支持。