中国生物工程学会会刊     创刊于2005年

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转录组学测序技术应用与市场分析

时间:2018-05-28来源:未知 点击:

广义上, 转录组(transcriptome) 是指特定的组织或细胞在某一生 长阶段或功能状态下所转录出来 的RNA总和,包括编码蛋白质的 mRNA和各种非编码RNA(ncRNA), 如rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA、 microRNA,以及其他非编码RNA等[1]。 狭义上,通常仅以mRNA作为研究 对象。

随着人类基因组计划的完成, 研究人员逐渐认识到对基因结构 序列的研究仅仅是基因组学研究的 一部分,并不能揭示所有的生命奥 秘,所以生物医学研究已从结构基 因组学过渡到功能基因组学。随着 后基因组时代的到来,转录组学、 蛋白质组学、代谢组学等各种组 学技术相继出现,其中转录组学 是率先发展起来以及应用最广泛 的技术[2]。

转录组学(transcriptomics)是 功能基因组学研究的重要组成部 分,是一门在整体水平研究基因功 能以及基因结构,揭示基因转录、转录调控规律以及疾病发生过程 中的分子机理的学科[3]。最近十 几年,随着分子生物学技术以及 高通量技术等的快速发展,使得 真正意义上的转录组学的研究成 为可能。尤其是随着下一代测序 (next-generation sequencing,NGS) 平台的市场化,转录组学测序技 术已经彻底改变了转录组学的思 维方式。目前,成熟的转录组学 测序技术以其整体性、系统性、 个体组织差异性、时间独立性等 优势,更好地推动转录组学研究。 本文从技术应用和市场两个角度, 梳理了目前转录组学测序技术的 发展现状,并对其未来发展趋势 进行了分析。

1 转录组学测序技术的发展 和应用前景

1.1 测序技术的发展进程

一般来说, 任何一种DNA 测序技术均可用于转录组学测序。 整体而言,随着测序技术的不断 发展,目前主要有三代测序技术 划分(图1)。

测序技术最早可追溯到20世 纪50年代由P. R. Whitfeld发明的 多聚核糖核苷酸测序技术。随着 F. Sanger在20世纪70年代发明了 DNA末端终止法测序技术,以及 随后A. M. Maxam和W. Gilbert发明 的化学降解法测序技术,标志着第 一代测序技术的产生和建立。第一 代测序技术的优点是准确度高,但 同时由于其测序通量低、成本高 昂、速度慢等技术缺陷,限制了其 在商业上的应用。

随着人类基因组计划的完成, 人类进入了后基因组时代,传统 的测序方法已经不能满足深度测 序和重复测序等大规模基因组测 序的需求,促使了新一代测序技 术的诞生。第二代测序技术是利 用一系列高通量测序技术(highthroughput sequencing)进行大规 模的基因组DNA或RNA测序, 能够快速准确地获得基因组编码 序列,满足极短时间内对基因组进行高分辨率检测的要求[5]。第 二代测序技术的主要特征是高通 量和边合成边测序,因此大规 模、测序速度快是其相对于第一 代测序技术的主要优势,而劣势 是较短的序列读长和需要模板扩 增过程。

第三代测序技术是指在单个 细胞、单分子水平上对基因组进 行测序的一项新技术,主要包括 Helicos Biosciences单分子测序技 术、Pacifi c Biosciences单分子实时 (single molecule real time,SMRT) 测序技术和Oxford Nanopore纳米 孔单分子测序技术3 种[4]。第三 代测序技术具有测序速度快、测 序序列长等优势,但也存在着测 序准确度不高的问题,大大限制 了其商业化的应用。因此,目前 测序市场仍以第二代高通量测序 技术为主。

1.2 转录组学测序技术应用前景

近几年,随着精准医疗、个 性化医疗等大计划的提出,促使 以转录组学研究为代表的功能基 因组学日益成为研究热点。转录 组学测序技术能有效帮助科学家 在转录层面找到疾病的直接或者 间接的病因,了解疾病的发生、 发展机制,从而制定个体化的精 准医疗方案,以期达到治疗效果 的最大化和副作用的最小化。

同时,随着第二代测序技术 高通量、高准确率、低成本等优 点的实现,转录组学测序技术也 随之得到了更广泛的应用。由于 测序深度的优势,基于NGS的转 录组学测序技术更能全面地揭示 生物个体在特定时刻和特定组织 的全局基因表达情况,具有更好 的整体性、系统性、个体组织差 异性以及时间独立性等优势。目 前,转录组学测序技术已广泛应 用于生物学研究、临床研究、相 关疾病研究和药物开发等[6]。据 Illumina的预估,未来全球测序 服务市场容量将达到200亿美元, 其中肿瘤学市场约占60%,达到 120亿美元左右;生命科学市场约 占25%,规模约50亿美元,具体 包括生命科学工具、复杂病症、 农业基因以及影响因子和宏基因 组等;生育和基因健康市场约20 亿美元,占比10%,具体业务包 含孕妇和新生儿童的监测,以及 基因健康等;其他应用市场约10 亿美元[7]。

2 转录组学测序技术应用发 展的现状与趋势

2.1 转录组学测序技术的主要分类

目前,转录组学测序技术包 括表达序列标签技术(expressed sequence tags,EST)、基因表达系 列分析技术(serial analysis of gene expression,SAGE)、大规模平行测 序技术(massively parallel signature sequencing,MPSS),以及RNA测序 技术(RNA sequencing,RNA-seq)[8]。 其中,EST是较早发展起来的先驱 技术,SAGE、MPSS和RNA-seq是 高通量测序条件下实现的转录组学 研究方法(图2),RNA-seq更是基 于NGS技术发展的测序技术,具 有测序通量高、速度快、价格低、 信噪比高等优势,已超越上述其 他方法,成为转录组学分析的主 要手段。

2.2 目前主要的转录组学测序技术

EST技术虽然可以直接检 测cDNA序列, 但其检测量较 低、价格昂贵且很难达到定量分 析的目的。相比之下,SAGE和 MASS技术是基于EST技术的升 级,克服了EST技术的缺点,采 用了数字化信号技术,具有高 通量、精确性高等特点。但是, 上述两种技术仍是基于Sanger 测序技术, 其测序成本昂贵, 且短的标签序列的有效部分不 能特异性地匹配到参照物基因 组上[3]。

RNA-seq, 又称为高通量 RNA测序,是利用深度测序技 术进行转录组分析的技术,其 基本原理是将RNA先反转录成 cDNA, 再对cDNA全部进行测 序。RNA-seq是第二代测序技术 的一个重要应用领域,与其他转录 组学技术相比,具有数字化信号、 高灵敏度、任意物种的全基因组分 析、更广的检测范围等诸多独特 优势(表1),目前已成为转录组 学研究中定量基因表达和进行转 录组测序、分析的主流工具[9]。此 外,RNA-seq具有重复性好、无 需技术重复、起始样品少等优势。 该技术能够在单核苷酸水平对任 意物种的整体转录活动进行检测, 在分析转录本的结构和表达水平 的同时,还能发现未知转录本和 稀有转录本,精确地识别可变剪 切位点以及编码序列单核苷酸多 态性(cSNP),提供更为全面的 转录信息[9]。

2.3 转录组测序主要应用平台

从测序技术的原理来说,所 有的高通量测序技术均可用于 转录组测序。自2005年以来,以 Roche公司的454技术、Illumina公 司的Solexa技术以及ABI公司(后 与Invitrogen公司合并为Life Technologies 公司,Life Technologies公 司于2013年被Thermo Fisher Scientifi c公司收购)的SOLiD技术为 代表的第二代测序技术逐渐成熟, 并迅速成为目前市场上转录组测 序的主流应用平台[10]。相对于传 统的Sanger测序技术,新一代测 序技术的主要特点是测序通量高, 测序周期和成本显著下降。目前, 全球的转录组学测序业务几乎被 上述三大巨头所垄断(图3)。

  

2.3.1 Roche公司454 Genome Sequencer

454公司在2003年推出了具 有革命性意义的基于焦磷酸测序 法(pyrosequencing)的超高通量 基因组测序系统,是边合成边测序(sequencing by synthesis,SBS) 技术发明的先驱。随后,454 公 司被Roche公司收购,推出了第 二代测序系统Genome Sequencer FLX System, 该技术的核心在 于微乳滴PCR(emulsion PCR, emPCR) 和并行焦磷酸测序法 (parallelized pyrosequencing), 避 免了传统测序进行荧光标记以及 跑胶等繁琐步骤,同时利用乳胶 系统对DNA分子进行扩增,实现 了大规模并行测序[12]。

2.3.2 Illumina公司Solexa Genome Analyzer

相对于454测序,Solexa测序出 现较晚,是合成技术的进一步发展 和延伸,由基因测序公司Solexa开 发。2007年,Illumina公司以6亿美 元收购Solexa公司,并推出了成熟 的商业产品Genome Analyzer[13]。该 技术核心是“DNA簇(DNA clusters)” 和“ 可逆性末端终结(reversible terminator)”,同样采用边合成边 测序的原理,同时借助高密度的 DNA单分子阵列,使测序成本和 效率均有了较大改善。虽然片段长 度较短仍是Solexa技术的瓶颈,但 与454技术相比,Solexa测序拥有 更高的通量,更低的成本,使其成 为第二代测序平台的首选[14]。目 前Illumina公司具有涵盖了低、中、 高端不同层次的测序产品,2011年 年底推出的MiSeq以其性价比高、 操作界面友好、数据产出易于分析 等特点迅速打入全球市场。其中, Genome Analyzer IIx被称为是全球 应用最广、性价比最高、产出最多 的测序仪。

2.3.3 ABI公司SOLiD System

2007年,美国ABI公司研发 出基于连接测序法(sequencing by ligation) 的SOLid(sequencing by oligonucleotide ligation and detection)测序技术。与454技术类 似,SOLiD系统同样采用了emPCR 技术和SBS技术。同时,该系统 的创新之处在于应用双碱基编码, 因此大大减少了测序带来的错误 率,同时可以方便地区分SNP和 测序错误[15]。具有较高的序列读 取精度和数据输出量是SOLiD系 统的主要优势所在,因此相同数 据量的测序价格略低于Solexa测 序的价格。然而从目前应用来看, SOLiD系统的测序应用范围不及 454技术和Solexa技术广泛,主要 原因是SOLiD系统没有明显的优 势,其读长不及Solexa技术,更比 不上454技术,而数据产出也远无 法和Solexa技术竞争。

总之,虽然3种技术各具优 缺点,但它们都使用了反应信号 的实时阅读,即边合成边测序, 省去了第一代基因测序中所需要 的利用电泳将序列片段分离后观 察结果的步骤,降低了测序所需 时间和成本(表2)[3]。

 

2.4 转录组学测序技术的发展趋势

高通量测序技术的发展使得 以转录组学为代表的功能基因组 学得到了前所未有的机遇和发展。 以RNA-seq为代表的转录组学测序技术已经显示出了较其他转录 组学研究技术巨大的优势,如为 物种提供单碱基分辨率的转录组 注释、提供全基因组范围的“数字 化”基因表达谱、成本比芯片和 Sanger测序更低等[16]。但是,不可 否认的是,转录组测序技术仍有很 多方面有待进一步完善。一是,测 序技术的改进和测序费用的进一步 降低。前述的三大平台测序过程中 仍存在一定的错误率,且读长普遍 较短,进行数据拼接时会遇到麻 烦。而以单分子测序和纳米孔测序 为标志的第三代测序技术将有望改 善上述缺陷。第三代测序技术在具 有超高通量的同时,也将保证测序 片段更长和出错率更低,并将进一 步降低测序的成本[17]。因此,基于 第三代高通量测序技术的转录组学 技术将是未来发展的趋势。二是, 测序上游的样品准备。目前的高通 量测序技术大多需要较多的样品起 始量,同时样品的准备步骤繁琐, 需经过加接头、反转、扩增、割胶 等多重步骤,这使得有限的生物样 品分析受到限制且成本巨大,因此 如何对少量样本甚至单细胞进行测 序亟待解决[3]。三是,生物信息学 分析软件的再开发。转录组学测序 技术带来了海量的数据,如何将海 量的数据转化为有用的数据也将是 转录组学研究的一个重要挑战[18]。

3 转录组学测序技术市场发 展的现状与趋势

3.1 转录组学测序技术市场潜力 巨大

美国市场研究公司Grand View Research发布的报告显示[19],2014 年全球转录组学技术市场(包括 微阵列技术市场、PCR技术市场、 基因调控技术市场以及下一代测 序技术市场)为22亿美元,预计 到2022年,这一数字将达到69.8 亿美元。报告还揭示,推动该市 场发展的主导因素包括药物制造 商与用户对个性化药物的追求以 及对精准医学的追求等。如美国 Cofactor Genomics公司的首席执 行官J. Glasscock表示, 公司约 80%的工作是与大型制药企业合 作,利用转录组学技术开发药物 靶标、疾病生物标志物以及确定 药物的不良反应等[20]。

同时,Grand View Research的 报告还揭示[19],个性化医疗以及 基因检测等需求的增长、个人及 政府对药物研究投资的增加也是 促进转录组学市场发展的重要因 素。此外,致癌物质以及遗传变 异等因素导致慢性疾病(肝炎、 糖尿病、癌症等)发病率的上 升,也是另一个推动转录组学市 场增长的因素。

3.2 基于NGS 的转录组测序技 术将成为市场驱动力

2017年,全球第二大市场研 究咨询机构MarketsandMarkets™ 发布的最新报告显示[21],预计到 2020年, 全球以RNA-seq为代表 的转录组学测序市场将从2017 年 的10.5亿美元达到26.5亿美元, 年复合增长率预计在20.2 % 左 右。RNA-seq产品相比于微阵列 技术的技术优势、功能基因组学 研究活动数量的增加以及个性化 医药快速增长的市场需求是促进 转录组学市场增长的关键因素。 另一方面,该报告还指出,诊断 测试中技术专业人员的缺乏以及 RNA-seq技术的标准化问题是限 制该市场增长的瓶颈。

3.3 北美地区仍是目前全球最大 的转录组测序市场

2016年,北美地区转录组测 序市场占全球主导份额,其次是 欧洲地区。促进北美市场发展的 主要驱动力是政府在基因组研究 方面提供的大量资金支持、RNAseq 产品的技术进步、目标疾病流 行率的增加、癌症和遗传性稀有疾 病的研究,以及有大量的转录组测 序主要参与者[19]。如报告指出[21], 以RNA-seq为例,全球该市场前 十位的参与者中,有一半是位于 美国的公司,如Illumina、Thermo Fisher Scientifi c、Pacifi c Biosciences、 PerkinElmer和Agilent Technologies, 其余公司包括QIAGEN N. V.(德国)、 华大基因(BGI,中国)、Oxford Nanopore( 英国)、GATC Biotech AG (德国)以及Roche(瑞士)。 此外,报告还指出,亚太地 区预计在2017 ~ 2022年将会成 为转录组测序发展增长最快的市 场[19]。与其他地区相比, 亚太 地区人口众多,来自中国、印度 等新兴市场的研发活动日益增 强,同时RNA-seq应用范围的扩 大,以及测序技术成本整体的降 低,巨大的人口基数和不断递增 的医疗需求,均是促进亚太地区 转录组测序市场快速发展的重要 因素。

3.4 转录组学测序技术市场竞争 激烈

整体而言,目前转录组测序 市场的特点是竞争激烈,以及创新产品世代更迭快。如自2005年 以来,Roche、Illumina、Life Tech (现已归属Thermo Fisher Scientifi c 公司)等公司相继推出或改良第 二代测序的新技术、新仪器和新 平台(图4)[11]。除了第二代测 序技术的不断更新与发展外,新 一代和第三代测序技术与产品也 在不断被发明和完善中。Helicos Biosciences的HeliScope单分子测序 技术、Pacifi c Biosciences的SMRT 测序技术和Oxford Nanopore的纳米 孔单分子测序技术等正逐渐进入商 业应用领域。2014年6月,Roche 公司收购了Genia Technologies公 司,以增强其使用纳米孔技术的 测序平台功能[19]。2016年12月, Oxford Nanopore公司向少数研究 人员推出了直接的RNA测序试剂 盒。目前,新的测序技术还在不 断被发明,每项技术都有超过前 代产品的特色。而低成本、低耗 时、高通量是未来的发展趋势, 随着序列技术的发展,其用途也 将更加广泛。