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工业生物技术——琥珀酸的生物制造:细菌还是酵母?

时间:2018-05-25来源:未知 点击:

琥珀酸又称丁二酸,是一种重要的有机合成中间体。许多微生物都可以 通过优化和代谢工程改造产生琥珀酸。文章对细菌和酵母两种主要的产琥珀 酸类群产琥珀酸的产量、产率及后提取等因素进行了详细的分析,并比较了 两种微生物生产琥珀酸 各自的优缺点,为今后开发利用琥珀酸的生物制造提 供参考。

1 琥珀酸简介

琥珀酸又称丁二酸,是一种安全的 天然有机酸,并且被美国能源部认为是 未来12种最具价值的生物炼制产品之 一。琥珀酸可以广泛地应用于清洁剂、 表面活性剂、食品添加剂、抗菌剂以及 制药行业,并用以合成多种重要化学 品,如γ-丁内酯、1,4-丁二醇、四氢呋 喃和2-吡咯烷酮等1 2 。同时,作为一种重 要的有机合成中间体,琥珀酸还是合成 多种聚酯(例如可降解聚酯PBS)的重要 前体物质3 。琥珀酸近年来逐渐攀升为大 宗化学品,全球琥珀酸的年产量在3万~5 万吨4 。根据MarketsandMarkets的调查报 告,琥珀酸的市场需求在2011~2016年间 会以18.7%的速率稳定增长。 传统上琥珀酸是化学合成的。该过 程需要金属Pd和Ru的催化,通过丁烷 制备顺式丁烯二酸酐再经化学方法加工 而成5 。但由于石油资源的减少和环境污 染问题,人们开始寻求一种资源可再生 的、高效环保的琥珀酸生产方式。而琥 珀酸是微生物细胞中心代谢三羧酸循环 (TCA)的中间代谢产物之一,并且还 是多种兼性厌氧菌和严格厌氧菌的代谢 末端产物,可以通过微生物利用可再生 的碳水化合物资源进行生产。

2 产琥珀酸的细菌

许多天然生产琥珀酸的菌株是从瘤 胃中分离出来的,如产琥珀酸放线杆 菌、产琥珀酸厌氧螺菌、曼海姆产琥珀 酸菌、脆弱杆菌。这些菌株都是兼性厌 氧或者严格厌氧的革兰阴性菌,嗜温、嗜CO2,并且对高浓度的琥珀酸有着良好 的抗渗透压性能6 7 。产琥珀酸放线杆菌 能够利用多种碳源发酵,并且对葡萄糖 和琥珀酸的耐受性可以高达158g/L和 104g/L 8 。Guettler等9 以葡萄糖为碳源用 产琥珀酸放线杆菌厌氧发酵生产琥珀 酸,产量可达106g/L,产率接近0.9g/g。 对产琥珀酸厌氧螺菌的研究大多数集中 在利用多种碳源为原料及菌株优化方法 上10。Meynial-Salles等11用产琥珀酸厌氧 螺菌进行连续的厌氧发酵得到83g/L的琥 珀酸,琥珀酸的生产力达到10.4g/(L·h)。 另外一种瘤胃细菌曼海姆产琥珀酸菌也 可以利用多种碳源生产琥珀酸。与产琥珀 酸放线杆菌不同的是,曼海姆产琥珀酸菌 能够有氧生长,有完整的TCA循环。曼海 姆产琥珀酸菌的琥珀酸生产能力弱于上 述两种天然宿主菌,文献中报道的其琥 珀酸产量大多在十几克12 13。而据报道, BASF/Purac JV公司分离得到的一种脆弱 杆菌,可以高效生产琥珀酸。 因为在自然界中这些微生物存在于 氨基酸和维生素丰富的地方,天然生产 琥珀酸的瘤胃菌株有许多营养缺陷型菌 株,所以这些菌株的生长需要昂贵、营 养丰富的培养基,导致琥珀酸的生产成 本增加7 。为了解决这些问题,人们开 始采用遗传背景研究清楚的、非天然生 产琥珀酸的工业生产菌株例如大肠杆 菌、谷氨酸棒杆菌,经过代谢工程改造 生产琥珀酸。

谷氨酸棒杆菌是一种生长良好、安 全易于控制的生产宿主,多用于氨基酸 的大规模生产14 。谷氨酸棒杆菌可以通 过双阶段发酵,在厌氧时还原的TCA途 径产生琥珀酸。通过细胞循环的分批补 料发酵方式,琥珀酸的产量高达146g/L, 产率达到1.4mol/mol15 。Litsanov等16 以 葡萄糖、甲酸和碳酸氢盐为底物发酵得 到134g/L琥珀酸,产率达到1.67mol/mol。 由此可见,利用谷氨酸棒杆菌生产琥珀 酸具有一定优势,但是由于生产过程需 要有氧-厌氧双阶段,会导致全阶段琥 珀酸产率较低,并且有氧阶段会大大增 加琥珀酸的生产成本。

大肠杆菌是一种兼性厌氧菌。厌 氧条件下,野生型大肠杆菌进行混合 酸发酵, 产物包括甲酸、乳酸、乙 酸、乙醇,以及少量的琥珀酸17。有氧 条件下生产琥珀酸需要失活琥珀酸脱 氢酶(SDH),阻断TCA循环中间体 琥珀酸向下游转化,也可以通过打开 乙醛酸支路来积累琥珀酸。在有氧条 件下,以葡萄糖为碳源生产琥珀酸得 率为1mol/mol18。而厌氧条件下的琥珀 酸发酵是通过还原的TCA支路和部分 乙醛酸支路进行,其中还原支路需要 固定一分子CO2,因此厌氧发酵有助于 减少温室气体的量,是一种环境友好 型生物过程,其理论产率为1.714mol/mol, 在额外补充足够还原力的情况下理论 产率更可以达到2mol/mol18。鉴于此, 厌氧是高效产琥珀酸的发酵方式。笔 者实验室构建的工程菌YL106/pSCsfcA以葡萄糖为底物进行全阶段发酵,琥珀 酸生产力达2.13g/(L·h),琥珀酸产量达 到85.3g/L,产率超过0.88g/g19。天津工业 生物技术所张学礼等20通过代谢进化技 术构建高效生产琥珀酸的菌株 HX024,厌氧发酵琥珀酸的产量达到 96g/L。然后又利用反向代谢工程技 术, 在出发菌株中激活磷酸戊糖途 径、转氢酶和丙酮酸脱氢酶,提高菌 株还原力NADH的供应,厌氧发酵琥珀 酸的产率提高到1.5mol/mol(理论产 率的88%) 20 。此前该课题组与山东兰 典生物科技股份有限公司合作完成了 琥珀酸10m3发酵罐中试,琥珀酸产率 达1.0g/g,提取收率达82%,纯度达 99.5%以上。Myriant公司也用工程化 的大肠杆菌生产琥珀酸,据称2013年 产量达到13 600吨。Myriant还与中国蓝 星集团合资生产琥珀酸。

3 产琥珀酸的酵母

细菌的培养和发酵需要一个接近中 性的环境,所以大肠杆菌和谷氨酸棒杆 菌等发酵生产琥珀酸的过程中需要不断 添加碱来维持pH稳定。这会增加发酵过 程中染菌的概率,使琥珀酸的下游工业 处理(DSP)过程更加复杂,造成琥珀酸 分离成本增加7 21。而酵母生长良好,性 能优良稳定,且可以在弱酸性条件下生 长,对各种工业条件下的压力都有显著 的抵抗性,如耐酸性、抗渗透性和耐高 底物水平。

酿酒酵母的底物来源广泛,培养条 件可以有氧也可以厌氧。在酵母中生产 琥珀酸最初是为了改善酿酒酵母所产的 酒的风味,研究主要集中在TCA循环中 的琥珀酸脱氢酶、延胡索酸酶(FUM) 等,最终产量小于0.7g/L 22。有氧条件 下,酿酒酵母的还原TCA还原支路在热 力学上不易发生,并且催化草酰乙酸生 产琥珀酸的酶受到葡萄糖的抑制23。因此 许多研究都集中在酿酒酵母在厌氧条件 下生产琥珀酸。通过敲除琥珀酸脱氢酶 和延胡索酸酶来阻断线粒体TCA循环积 累琥珀酸24 25。也可以通过敲除琥珀酸脱 氢酶、异柠檬酸脱氢酶(IDP1)利用氧 化的TCA循环和乙醛酸途径共同积累琥 珀酸26。与大肠杆菌类似,酵母的厌氧理 论产率高于有氧理论产率。Yan等27敲除 酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶(PDC)、延 胡索酸酶基因,并且优化胞质内还原 TCA支路各步骤的酶,得到12.97g/L琥 珀酸,产率为0.21mol/mol葡萄糖,发 酵pH维持在3.8。Verwaal等28也通过相 似的方法,利用酿酒酵母还原的TCA途 径生产琥珀酸,产量达到43g/L。工业 生产中,DSM/Roquette合资公司以酿 酒酵母为生产菌株,但没有获得其最终 生产指标。

解脂耶氏酵母是被广泛研究的一类 非惯用酵母,严格好氧,需利用完整的 TCA循环来维持生长29 。解脂耶氏酵母 可以利用的底物很广泛,如葡萄糖、乙醇、脂肪酸、油脂和正构烷烃等,因为 它能积累大量的有机酸,尤其是TCA循 环的中间体柠檬酸、异柠檬酸和α-酮戊 二酸等,是一种重要的工业菌株。一些 学者通过突变琥珀酸脱氢酶,筛选酶活 力降低的突变株来积累琥珀酸30 。Kamzolova 31以构建好的α-酮戊二酸解脂酵 母为生产菌株,以乙醇为底物在过氧化 氢存在的情况下脱羧生产琥珀酸,琥珀 酸的产量为71.7g/L,并且发酵液中琥 珀酸的回收率达到72%。Yuzbashev等30 利用突变了琥珀酸脱氢酶的解脂酵母, 以甘油为底物、碳酸钙为缓冲剂进行 低pH琥珀酸发酵,得到45g/L的琥珀 酸。笔者实验室构建的琥珀酸脱氢酶突 变的解脂酵母以甘油为底物,通过长 时间发酵最后得到160g/L琥珀酸,说 明其对琥珀酸具有较高的耐受力(文 章在投)。

4 细菌与酵母琥珀酸生物制造 过程比较

目前,在琥珀酸的产量、产率和生 产力方面,细菌都具有一定的优势, 而报道的酵母生产琥珀酸的产量、产 率和生产力都不高(表1)。酿酒酵母 具有较好的耐受能力,特别是对pH的 耐受性较高,而细菌对酸和渗透压力 耐受性低,发酵过程中需要调节pH,这会增加生产成本,也使发酵过程更 易染菌。然而,酵母维持细胞外大量的 琥珀酸以游离状态存在,将需要消耗胞 内的能量来维持胞内pH和阻止酸顺浓 度梯度的跨膜运输。这种额外消耗能 量对酵母的厌氧生产过程不利,因为酵 母厌氧过程产生的ATP很少,主要依赖 底物水平磷酸化而非有氧时的氧化磷 酸化。作为弱酸,琥珀酸在低pH的培 养基中会转换为不溶的形式,与带电 分子的形式相比,不溶的琥珀酸可以 通过被动扩散穿过胞质膜进入细胞。 为了解决这一问题,研究者提出微好氧 发酵这一策略,使一部分底物通过氧化磷 酸化,产生的ATP可以补充厌氧支路 ATP缺少的情况30。



影响琥珀酸生产成本的最主要阶 段是琥珀酸提取纯化阶段(表2)。细 菌发酵中得到的琥珀酸盐需要转化为 游离琥珀酸,该阶段的成本大概占到 产物成本的60%~70%32。酵母可以进 行低pH的生物发酵,除去菌体后的发 酵液可以直接蒸发结晶,而需要中性 环境的细菌生产琥珀酸过程,要先进 行电渗析或者酸化超滤过程再蒸发结 晶,其中电渗析过程需要大量能量,酸 化过程还会有副产物硫酸铵的产生33。 酵母低pH(小于3)的生物发酵直接把 底物转化为琥珀酸,这使产物的下游处 理步骤少于细菌发酵。综上所述,就目 前琥珀酸的产量、产率与生产力而言, 工程化的大肠杆菌似乎更具有优势。但 是,从长远来看, 考虑到工业生产成 本,如果解决了酵母生物转化的产率和 生产力较低的问题,也许酵母比大肠 杆菌更适于琥珀酸的生物制造。

[致谢:本项目得到了国家自然科学 基金(31170097),山东省科技发展计划 (2015GSF121042)及微生物技术国家重点 实验室(M2014-03)的资金支持。]